癌症免疫疗法在对抗恶性肿瘤方面有巨大的潜力。信使核糖核酸（mRNA）是近来研究火热的一种通用工具，在细胞质内发挥作用，消除了在以往质粒DNA (pDNA)中的无意插入或突变的风险(图1)，具有编码肿瘤抗原（TA）、免疫细胞受体、细胞因子和抗体的能力，而mRNA固有的结构不稳定性，因而需要开发有效的递送系统。脂质纳米颗粒（LNPs）已成为癌症免疫疗法中mRNA递送的重要介质之一，为mRNA提供保护并提高细胞内递送效率。
这里将讨论基于LNP的mRNA递送系统在癌症免疫治疗中各种应用的最新进展，包括mRNA编码的肿瘤疫苗、工程化CAR-T、佐剂、细胞因子和抗体，重点是优化癌症治疗中mRNA编码疗法的设计和递送策略。此外，也将深入研究该领域遇到的挑战，并展望未来的前景，旨在提高基于LNP的mRNA癌症免疫疗法的安全性和有效性。▲图1 基因传递过程示意图，突出显示pDNA和mRNA途径。利用外源mRNA编码的靶抗原，通过MHC I类和II类分子肽呈递，激活细胞和体液免疫反应，最终有助于消除肿瘤。
LNPs可以作为包裹小分子、核酸、小干扰RNA (siRNA)和mRNA的药物递送系统，由可电离脂质、辅助脂质、胆固醇、聚乙二醇(PEG)脂质和mRNA组成(图2a)。可电离脂质的特点是其pH敏感性，由于其头部基团具有转移电荷的能力，可从低pH下的正电荷状态过渡到生理pH下的中性状态，这种特性使它们能够形成“mRNA离子化的阳离子脂质”复合物，以ph依赖的方式稳定和保护mRNA。另一个关键成分，PEG-脂质，通过避免巨噬细胞的活化和吞噬作用，延长体循环，增强稳定性。PEG-脂质的选择取决于PEG的摩尔质量和脂质长度，可以影响靶向递送和细胞摄取效率。辅助性脂质和胆固醇在LNP形成过程中起重要作用，控制LNP的流动性或刚性。特别是胆固醇，会影响LNP的有效递送和分布，通过特定的修饰还可以选择性靶向某种细胞类型。▲图2 LNPs的组成及其作为递送载体的优势
基于LNP的mRNA癌症免疫治疗主要采用四种策略(图3):
(1)通过编码肿瘤抗原（TA）激活免疫应答
(2)表达抗原受体，如CAR或T细胞受体(TCR）
(3)编码佐剂刺激免疫
(4)编码免疫相关蛋白(如细胞因子、抗体)
下面将详细叙述这几种方法的研究进展
▲图3 基于LNP的mRNA递送策略示意图。
TA是癌细胞中表达的蛋白质，被免疫系统识别为外源，通过抗原呈递细胞(APCs)呈递给T细胞和B细胞，这可以诱导强大的抗癌免疫反应。主要有全长蛋白、抗原肽或编码特定癌症抗原的pDNA几种形式。有研究以为个性化新抗原作为树突状细胞(DC)疫苗，具有有效的抗肿瘤作用。在临床试验中，评估了自体肿瘤mRNA在恶性黑色素瘤中引发免疫反应的可行性（Phase I/II trial of melanoma therapy with dendritic cells transfected with autologous tumor-mRNA）。mRNA编码TA转染的DC已成为一种有效的癌症治疗策略，在脑癌、前列腺癌、肾细胞癌和黑色素瘤的临床试验中显示出长期生存率。值得注意的是，50%的转移性黑色素瘤患者单独接种DC疫苗或联合使用白细胞介素(IL)-2，长期生存无严重不良反应。鉴于这些抗肿瘤作用，Oberli等人优化了LNPs，并在黑色素瘤体内模型中证明mRNA编码的TA在细胞内递送至APCs，促进细胞毒性CD8 + T细胞反应。另一项研究中（DOI:10.1016/j.biomaterials.2020.120431），在OVA荷瘤小鼠模型中，LNP-OVA mRNA和C16-R848能有效抑制肿瘤生长(图4a-f)。Sasaki等人报道了利用微流体装置选择合适的尺寸和脂质组成来优化LNPs的方法，该研究通过递送E.G7-OVA mRNA，并将其与其他两种LNP配方进行比较，结果显示A-11-LNP为最佳配方。A-11-LNP组在DC中表现出优越的基因表达活性和成熟程度，在E.G7-OVA肿瘤模型中表现出明显的抗肿瘤治疗作用。▲图4 mRNA-LNPs癌症疫苗 (a). 加载mRNA的LNPs的示意图和实验方法。(b). A11-LNPs对E.G7-OVA荷瘤小鼠的抗肿瘤活性。(c). 分别于第8天和第11天静脉注射含OVA mRNA的制剂，以0.03 mg mRNA/kg剂量注射A-11-LNPs、MC3-LNP、RNA-LPX和B-8-LNPs对E.G7-OVA荷瘤小鼠的抗肿瘤活性。(d - f ). 以0.03 mg mRNA/kg剂量静脉注射OVA mRNA制剂24 h后脾脏DCs中活化标记物CD40 (d)、CD80 (e)和CD86 (f)的表达。(g). 接种疫苗和抽血的实验时间表。(h). 第12天用113-O12B/mOVA和ALC-0315/mOVA处理小鼠的OVA特异性抗体滴度。(i). 第二次接种后第7天CD3 + CD8 + T细胞内IFN-γ阳性细胞流式图。(j). B16F10-OVA肿瘤模型的肿瘤体积。 (k). 静脉注射B16F10-OVA细胞18天后采集的肺。在另外一项研究中，Chen等人报道了一种基于LNPs的淋巴结靶向mRNA疫苗，命名为113-O12B，用于癌症免疫治疗(图4 g-k)。在携带B16F10-OVA的体内模型中，将mRNA靶向递送到淋巴结引发了CD8 + T细胞对编码的全长OVA的强烈反应。
工程免疫细胞疗法可以特异性识别癌症细胞，具有治疗癌症的潜力。mRNA编码的CAR在体外或体内递送至免疫细胞，并表达在细胞表面靶向癌症细胞。几项临床/临床前研究已经证明了mRNA编码的CARs在癌症免疫治疗中的潜力（DOI:10.1016/j.ymthe.2019.01.018）。Billingsley等人通过开发可电离脂质和用各种组合优化LNP文库，证明基于LNP递送mRNA平台生成的CAR-T细胞治疗可行性（图5）。LNP包封的编码CD19 CAR的mRNA，与电穿孔相同或更高的水平表达CD19 CAR，基于这种方式产生的CAR还可以应用到NK细胞疗法，尽管这种方式更具潜力，但目前应用更多的还是病毒载体。▲图5 编码CAR的mRNA-LNP递送系统。(a) 使用CAR mRNA负载的LNP靶向T细胞的示意图。(b) 使用微流体技术生成LNP。（c）通过流式分析CAR在原代T细胞中的表达率，纯化的LNP和电穿孔（EP）组中的CAR在T细胞上表达增加。（d）细胞活力评估，LNP对细胞的损伤相较电穿孔更小。基于mRNA的CAR的一个显著限制性因素是表达的持续时间相对较短，这种短暂性表达可能会限制其治疗效果，为了克服这一挑战，研究人员正在探索提高mRNA稳定性和延长CAR表达持续时间的策略，包括优化mRNA序列和结构，优化LNP制剂增强细胞内递送和释放，使mRNA编码的CARs能够持续或重复给药。
免疫原性佐剂调节有助于抗原识别、共刺激分子上调和细胞因子产生的信号。Toll样受体（TLRs）识别多种病原体中存在的保守结构，并触发先天免疫反应，特别是I型干扰素（IFN）的产生。由于TLR激动剂能够连接先天免疫反应和适应性免疫反应，因此作为癌症的佐剂是非常有前途的。干扰素基因刺激因子（STING）是一种在先天免疫反应中发挥关键作用的蛋白质，STING的激活触发转录因子（干扰素调节因子，IRF-3）和CD8+T细胞的免疫信号级联。由于其在免疫反应中的核心作用，STING已成为开发癌症免疫疗法的一种有前途的研究方向。在一项研究中，将LNP封装的mRNA疫苗与佐剂（IFN基因刺激因子STING-V155M突变）相结合，增强了临床前模型和临床研究中的免疫反应（图6）（DOI:10.1016/j.ymthe.2021.03.002）。该佐剂最初在一名婴儿期发作的STING相关血管病（SAVI）患者中发现，可以极大的提高CD8+T细胞，增加疫苗的免疫原性反应和通过核因子κB（NF-κB）和IFN刺激反应元件（ISRE）激活I型IFN途径。当与靶向人乳头瘤病毒（HPV）癌蛋白的mRNA疫苗一起使用时，STING-V155M在接种疫苗的小鼠中降低了肿瘤生长并提高了存活率，这些表明mRNA编码的佐剂在癌症免疫疗法中的潜力。▲图6 mRNA编码佐剂的LNP递送系统。(a) 用编码STING的mRNA-LNPs治疗后C57BL/6小鼠血清中的细胞因子水平。（b）用编码STING的mRNA-LNPs治疗后脾脏中IFN-γ、TNF-α和IL-2的流式分析。（c）E6/E7中观察到的肺转移减少。(d) 用编码STING的mRNA-LNPs处理小鼠的存活率。
细胞因子在调节免疫系统功能方面起着关键作用，是首批癌症治疗药物之一。IFN-α和IL-2是白血病、转移性癌症和黑色素瘤的代表性免疫治疗剂。然而，以往制剂方法已经暴露了很多问题，如直接注射蛋白半衰期短，大量注射又会导致全身毒性，再有pDNA存在的不可控基因整合风险及表达效率低等。为了克服这些问题，编码细胞因子的mRNA和递送系统备受关注。IL-12被称为一种T细胞刺激因子，在临床前模型中显示出强大的抗癌活性，但在血液中扩散后也会引起全身毒性。有研究利用LNP包封编码IL-12和lumican的mRNA。Lumican将IL-12保留在肿瘤微环境（TME）中，减少副作用。LNPs包裹的mRNA诱导免疫原性细胞死亡（ICD）在体外和体内得到证实，导致I型IFN、TLR3的有效诱导，并增强TME内的免疫记忆（图第7a、b）。▲图7 编码细胞因子的mRNA-LNP递送系统。(a) 引发肿瘤免疫的示意图。（b）用编码IL-12的mRNA-LNPs处理的B16F10肿瘤模型中的肿瘤体积和存活率。(c) 测量编码IL-23、IL-36γ和OX40L的mRNA-LNP处理的肿瘤体积，在MC38-R肿瘤模型中显示出抗癌作用。（d）编码IL-23、IL-36γ和OX40L的mRNA-LNPs处理引起的肿瘤体积缩小。(e) 编码IL-12、IL-27和GM-CSF的mRNA-LNP递送系统示意图。(f) 用IL-27、IL-12或GM-CSF mRNA负载的MC3 LNP或DAL4 LNP处理后的细胞因子浓度。(g) 在用DAL4 LNP包封的mRNA处理的B16F10小鼠模型中测量的肿瘤大小。(H) 用mRNA负载的DAL4 LNPs处理的B16F10小鼠模型中的存活率。
IL-1和IL-12家族协同进行抗炎和抗肿瘤免疫反应。IL-1家族（IL-1、IL-18、IL-33、IL-36、IL-37和IL-38）参与抗原侵袭后的早期免疫反应。已知IL-36与癌症的良好预后相关，并刺激APC和T细胞。IL-12家族细胞因子是先天免疫和适应性免疫之间的桥梁。IL-23是IL-12家族的一员，调节免疫反应并表现出抗肿瘤作用。Hewitt等人设计了编码OX40、IL-36和IL-23的mRNA-LNP的递送系统对肿瘤进行单药治疗和联合治疗（图7c，d）。LNP递送的三种（OX40、IL-36和IL-23）mRNA有效地激活了DC和T细胞，与单独的mRNA相比，抗癌效果显著增强。这些策略引发了先天和适应性免疫反应，使肿瘤再次受到攻击，也能有效地预防肿瘤复发。在另一项研究中，证明了使用编码细胞因子的mRNA-LNP进行抗癌治疗（图7e–h）(DOI:10.1016/j.jconrel.2022.03.021）。这些细胞因子（IL-12、IL-27和GM-CSF）表现出协同作用，增加T细胞在TME中的存活率，并用IFN-γ和IL-10促进记忆性T细胞，在黑色素留模型中具有显著的肿瘤抑制作用，且没有毒性。IL-12和IL-27的组合吸引了B细胞、巨噬细胞、CD4+/CD8+T细胞和NK细胞，证明了多种细胞因子的mRNA-LNP递送系统聚集免疫细胞并提供有效治疗的潜力。
抗体治疗在临床上取得了卓越的疗效，然而仍存在一定的局限性。稳定性问题、大规模制造的复杂性和治疗成本可能会阻碍其广泛应用。通过递送编码抗体的mRNA在体内产生抗体，这种方法可以解决目前抗体存在的局限性和挑战。HER2抗体（即曲妥珠单抗）是靶向HER2治疗癌症的鲜明例子，当曲妥珠单抗与癌症细胞的HER2结合时，它通过阻断癌症细胞的增殖和存活途径达到抗癌作用。基于这一机制，Rybakova等人通过LNP递送表达曲妥珠单抗的mRNA（图8a–d）（DOI:10.1016/j.ymthe.2019.05.012）。在将其注射到小鼠中，血清中表达的曲妥珠抗体的浓度逐渐增加，直到7天后消失（图8c）。这意味着编码抗体的mRNA-LNP递送可替代传统抗体疗法。▲图8 编码抗体的mRNA-LNP递送系统。(a) 编码曲妥珠单抗重链和轻链的mRNA的示意图。(b) 在通过尾静脉以不同剂量注射曲妥珠单抗mRNA的cKK-E12 LNPs后24小时，C57BL/6小鼠血清中的曲妥珠单抗浓度。(c) 单次静脉注射8 mg/kg赫赛汀（Genentech）或2 mg/kg cKK-E12 LNPs后，曲妥珠单抗在C57BL/6小鼠血清中的药代曲线。（d）用曲妥珠单抗mRNA治疗的小鼠中HER2阴性（MDA-MB-231）和HER2阳性（MDA-MB-231-HER2）肿瘤的生长，箭头表示mRNA LNP注射的天数。（e）IVT双（scFv）2和Fab-（scFv）2 RiboMABs的结构。(f) 注射脂质包封mRNA后内源性CD3×CLDN6 RiboMAB的体外细胞毒性(左)和浓度(Cp)(右)。 (g) 小鼠用CD3×CLDN6或荧光素酶mRNA处理(n = 6/组;3次剂量，静脉注射每周3µg/只)，与纯化的CD3×CLDN6蛋白(200µg/kg)或对照(n = 7/组)，每周腹腔注射3剂，共10剂，单个小鼠的肿瘤生长情况(左，mRNA;右，重组蛋白)。（h）小鼠用两剂量CD3×CLDN6 mRNA (n = 4)或荧光素酶mRNA作为阴性对照(n = 4)(均为3µg/小鼠每周静脉注射)。肿瘤浸润淋巴细胞(人CD3 +细胞;左)和表达CLDN6的肿瘤细胞(右)在三个连续的肿瘤切片中通过免疫组织化学进行定量。（i）在BHK细胞中表达的mRNA编码的利妥昔单抗与Raji细胞的结合。所示为所有活细胞的藻红蛋白（PE）荧光的中位数。（j–m）mRNA编码的单克隆抗体保护小鼠免受致命的肿瘤攻击。每组包括12只小鼠。（j）在肿瘤形成后的指定时间通过全身发光成像评估肿瘤发展。（k）接受静脉注射10或50µg编码利妥昔单抗的mRNA LNP的小鼠的存活率。（l）肿瘤形成后第13天，用两种不同剂量的编码利妥昔单抗的mRNA LNP处理的小鼠或未处理的小鼠的代表性发光图像。（m）接受静脉注射50µg编码利妥昔单抗或对照抗体的mRNA LNP或200µg重组利妥昔mab的小鼠的肿瘤发展。Sahin的团队设计了编码CD3和Claudin6（CLDN6）（TAA之一）的RiboMABs的mRNA（图8e–h）（DOI:10.1038/nm.4356）。将CD3×CLDN6-RiboMAB LNPs注射小鼠后，随着时间的推移检测其在血清中的浓度，mRNA在144小时内逐渐减少，而抗体蛋白在给药6小时后迅速消失。与对照组和抗体蛋白治疗组相比，CD3×CLDN6 RiboMAB治疗卵巢癌异种移植小鼠模型可完全消除肿瘤。该研究表明，低剂量的基于LNP的mRNA可以重复给药和复制，可以持续产生抗体，克服了抗体疗法半衰期短的局限性，并展示了其潜在的临床应用性。在另一项研究中，Thran等人探索了利妥昔单抗（用于靶向治疗淋巴瘤的CD20抗体）的用途，并研究了化学修饰的mRNA在被动免疫中的效用。他们设计了包裹在LNP中的利妥昔单抗mRNA，并评估了其抗肿瘤作用（图8i–m）（DOI:10.15252/emmm.201707678）。在体内淋巴瘤模型中，与用重组利妥昔单抗抗体治疗的组相比，用LNP mRNA治疗的组表现出更高的肿瘤抑制率和存活率。此外，单次注射mRNA-LNP足以实现快速、稳定和持久的血清抗体滴度，从而对致命的狂犬病感染或肉毒杆菌中毒提供预防和治疗保护。这些发现表明，编码抗体的mRNA-LNP比其重组蛋白提供更好的递送和治疗效果。
总之，基于mRNA的治疗策略近来备受关注，因为其制造简单，并且能够在没有基因组突变的情况下编码蛋白质。然而，由于mRNA结构不稳定，需要一种有效的载体或递送载体来增强内吞作用。随着纳米颗粒靶向递送技术的出现，LNP已成为一种创新的递送平台，可提高mRNA的稳定性和细胞内递送效率，使其成为癌症免疫疗法的极具前景的候选者。编码癌抗原、CAR、佐剂、细胞因子和抗体的mRNA也证明了减少肿瘤生长的潜力，进一步强调了LNP促进的基于mRNA的癌症免疫疗法的潜力。随着该领域的不断深入研究和开发，我们预计会出现更有效、更个性化、更安全的治疗方案。最终，这些迭代进步将会不断提高治疗效果，提升癌症患者的生活质量。Han, J., Lim, J., Wang, CP.J. et al. Lipid nanoparticle-based mRNA delivery systems for cancer immunotherapy. Nano Convergence 10, 36 (2023). Tse SW, McKinney K, Walker W, Nguyen M, Iacovelli J, Small C, Hopson K, Zaks T, Huang E. mRNA-encoded, constitutively active STINGV155M is a potent genetic adjuvant of antigen-specific CD8+ T cell response. Mol Ther. 2021 Jul 7;29(7):2227-2238.Foster JB, Barrett DM, Karikó K. The Emerging Role of In Vitro-Transcribed mRNA in Adoptive T Cell Immunotherapy. Mol Ther. 2019 Apr 10;27(4):747-756.Stadler, C., Bähr-Mahmud, H., Celik, L. et al. Elimination of large tumors in mice by mRNA-encoded bispecific antibodies. Nat Med 23, 815–817 (2017).Moritz Thran, Jean Mukherjee,. et al. mRNA mediates passive vaccination against infectious agents, toxins, and tumors.EMBO Mol Med (2017) 9: 1434–1447